TILLING-高通量点突变筛选方法 反向遗传学方法是功能基因组研究的重要方法。为了克服传统的基因敲除方法的局限性,TILLING(Targeting Induced Local Lesions In Genomes)技术通过化学诱变的方法产生的大量点突变个体,可以对部分功能缺失的基因及基因分型中亚致死等位基因进行研究。目前,TILLING技术已被大量应用于拟南芥、果蝇、玉米、斑马鱼、苜蓿等多个物种的研究领域。

Ecotilling-高通量SNP发现新方法 SNP可以用来研究物种间不同个体的遗传差异,疾病基因找寻,重要性状相关基因定位等。SNP的找寻需要获得大量个体DNA样本的序列信息,通过大规模测序,可以获得足够的序列信息,从而筛选出SNP。但是该方法耗费巨大,耗时较长。Ecotilling技术的出现,解决了传统测序的缺陷,不仅分析速度更快,而且耗费很低,尤其适合大规模人群和动植物群体中找寻新的SNP位点,它和Tilling的区别是,Ecotilling使用的材料是自然环境中的群体,而非突变体,后续的实验技术流程与TILLING相同。

高质量的的TILLING/Ecotilling图像 双色红外荧光检测,产生两个真实的凝胶电泳图像。未经加工的原始图像防止了突变被过滤得可能性。

双色检测消除假阳性结果 错配的异源双链经酶切后,产生两个片段。两个片段由不同的荧光标记(如右图)。泳道的两条突变片段分子量之和应该等于野生型的分子量,满足条件方可以确定突变。

突变定位 成像程序可以识别存在突变样品位点的泳道并估算条带的分子量,进行突变位点的定位分析。

高灵敏度的红外检测 红外技术的高灵敏度避免了一些弱信号的丢失。与其他可见荧光相比较 ,红外技术具有更宽的动力学范围,弱的突变条带和强的野生条带同时生成高质量的图象。

技术成熟 我们所采用的Licor遗传分析系统是TILLING/Ecotilling技术的最佳选择。拟南芥Tilling计划(ATP)已经用Licor 4300找到了200多个基因的2000多株突变株。TILLING 和 ECOTILLING 实验流程

拟南芥的TILLING流程操作示意图

经EMS处理后产生点突变的种子

第一代植株

自交产生的性状分离个体

提取植株DNA样本于96孔中

将8块微孔板样品合成一块,用两种红外标记的引物做PCR

PCR产物经变性和复性,野生型与突变型样品形成异源双链。

CEL I 核酸内切酶特异性切断错配的碱基

样本变性后在4300 DNA分析仪上电泳

在含有突变样本的泳道,野生型条带的下方可以观察到条带。700nm和800nm通道均可成像。

在混合的8个样本中进一步确定突变样本。

Ecotilling的流程从步骤4开始,没有诱变的过程。后续实验过程与TILLING相同。